Che cos'è la cromatografia liquida?

Esistono due tipi di cromatografia: la gascromatografia - che separa i componenti volatili di un campione gassoso - e la cromatografia liquida, che separa le molecole in soluzione. Tra i due metodi di separazione, la cromatografia liquida (LC) è il metodo più utilizzato.

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Il funzionamento della cromatografia liquida

La cromatografia liquida è un tipo di cromatografia ampiamente utilizzato per separare gli analiti presenti nel campione (soluto). Tale campione viene diluito in un solvente denominato fase mobile. La separazione avviene in base alle interazioni chimiche tra le molecole del campione e la fase stazionaria (substrato).
La cromatografia liquida può utilizzare sia la permeazione con un gel sia lo scambio ionico. La permeazione con gel consiste nel separare le molecole in base alla loro dimensione, mentre il metodo a scambio ionico consiste nel separare gli ioni in base alla loro carica.
La separazione può essere effettuata sia in colonna sia su lastra con una fase mobile liquida e un supporto solido come fase stazionaria. I rivestimenti interni della colonna possono essere molto diversi a seconda di ciò che si desidera analizzare, tenendo conto delle interazioni supporto-campione.
La fase mobile si sposta lungo la fase stazionaria, eluendo i componenti del campione che vengono separati durante la cromatografia. In LC, l'interazione tra le molecole del campione e il supporto cromatografico è influenzata da diversi fattori quali dimensioni, carica, legame per affinità, adsorbimento o idrofobicità.
La cromatografia liquida viene utilizzata per separare (separazione molecolare) composti solubili poco sensibili al calore (proteine, ecc.). Trova così le sue principali applicazioni nei laboratori di farmacia o di ricerca.

Tipi di cromatografia liquida

Esistono diversi tipi di cromatografia liquida:

Cromatografia liquida - LC.
Cromatografia liquida con rivelatore di spettrometria di massa - LC/MS
Cromatografia in fase supercritica: questo metodo utilizza le proprietà della CO2 che, in determinate condizioni di pressione e temperatura (>31 °C e >73 b), diventa un fluido supercritico.

Tecniche avanzate di LC

La cromatografia liquida a elevate prestazioni o cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) è una tecnica avanzata di LC. Utilizza una pressione elevata (20-150 b) per forzare il campione attraverso la colonna finemente impaccata e ottenere risultati in tempi brevi, anche per quantità vicine alla soglia di rilevamento, con elevata affidabilità e precisione. Attualmente è il metodo di analisi più utilizzato nei laboratori di analisi e nell'industria farmaceutica.

LC-MS, affidabilità e versatilità

La cromatografia in fase liquida abbinata a rivelatori di spettrometria di massa è un metodo analitico che combina le due tecnologie. Offre versatilità (possibilità di identificare una gamma più ampia di molecole) ed efficacia (ad es. molecole molto complesse) per identificare e/o quantificare con precisione numerose sostanze. Questa tecnologia, inizialmente costosa, sta diventando sempre più accessibile e in continuo sviluppo.

Cromatografia a fluido supercritico senza solvente chimico

Questa tecnica utilizza come solvente la CO2, un gas che diventa solvente in condizioni di temperatura superiori a 31°C e a una pressione di 73 bar. La cromatografia liquida con CO2 presenta tutti i vantaggi di un solvente classico pur essendo più rispettosa dell'ambiente. Il campione viene diluito in fase liquida ed è rapidamente disponibile in fase gassosa per una maggiore efficacia. A differenza di un solvente convenzionale, la fase aggiuntiva di rimozione del solvente mediante lavaggio con azoto non è necessaria.

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Differenza tra gascromatografia e cromatografia liquida

Come suggerisce il nome e a differenza della gascromatografia, la cromatografia liquida utilizza una fase mobile liquida. I liquidi sono generalmente miscele di solventi di polarità compatibili mentre nella gascromatografia la fase mobile è un singolo gas ad alto livello di purezza.

Cromatografia supercrítica sem solventes químicos

Molte altre caratteristiche differenziano questi due metodi, elencate nella seguente tabella:

Cromatografia liquida	Gascromatografia
La fase mobile è un liquido.	La fase mobile è un gas.
La separazione si basa sull'interazione degli analiti nel campione con la fase stazionaria.	La separazione si basa principalmente sui diversi punti di ebollizione degli analiti nel campione.
Utilizzata per separare qualsiasi composto solubile, ad esempio amminoacidi, proteine, farmaci, acidi nucleici, lipidi, antiossidanti, carboidrati e polimeri naturali e artificiali.	Adatta alla separazione di composti volatili e miscele di gas.
Generalmente eseguita a temperatura ambiente, questa tecnica permette di analizzare in tutta sicurezza i composti sensibili al calore.	Necessita condizioni analitiche con elevate temperature, pertanto non è adatta alle sostanze termicamente sensibili e termolabili.
Si tratta di una tecnica relativamente lenta.	L'analisi è più rapida e generalmente si conclude in pochi minuti.
Utilizza solventi liquidi polari come acqua o metanolo.	Utilizza un solvente con basso punto di ebollizione.

Cromatografia

I gas in queste tecnologie

Nel caso di LC-MS o HPLC-MS, il rivelatore MS, quando utilizzato, richiede un flusso di Azoto per eliminare efficacemente il solvente dal campione prima della fase di identificazione e quantificazione nel rivelatore. Dato che un LC-MS consuma tipicamente 10 M3/giorno, ovvero l'equivalente di una bombola di 50 litri, sono disponibili diverse soluzioni per il laboratorio a seconda del numero di LC-MS e del loro tasso di utilizzo:

Bombole o pacchi con centrale di inversione.
Contenitore per liquidi con evaporatore.
Generatore di azoto. Questa soluzione è possibile tenendo conto della qualità dell'Azoto richiesta dal produttore dell'analizzatore (intorno a N30, ossia una purezza del 99,9%). L'utilizzo di un generatore di Azoto è comune e pratico. Questa strumentazione necessita di manutenzione e per questo motivo si consiglia vivamente di prevedere una riserva con bombole e un sistema di rete di gas.

La cromatografia liquida a fluido supercritico utilizza CO2 (qualità Alphagas SFC - 99,998%) fornita in forma liquida in base a diverse opzioni a seconda dei volumi necessari: